Weird Science

Enzymy - biologiczne katalizatory

Poniższy arty­kuł został opu­bli­ko­wany pier­wot­nie w cza­so­pi­śmie dla nau­czy­cieli Che­mia w Szkole (3/2016):

Ilustracja

Ples M., Enzymy - bio­lo­giczne kata­li­za­tory, Che­mia w Szkole, 3 (2016), Agen­cja AS Józef Szew­czyk, str. 6-11

Enzy­mami nazy­wamy wiel­ko­cząstecz­kowe, naj­czę­ściej białk­owe sub­stan­cje, które pełnią funk­cję bio­lo­gicz­nych kata­li­za­to­rów o bar­dzo spe­cy­ficz­nym dzia­ła­niu. Przy­spie­szają one różn­o­rodne reak­cje, skła­da­jące się na che­miczny aspekt zja­wi­ska, które nazy­wamy życiem.

Więk­szość reak­cji, w których biorą udział opi­sy­wane związki prze­biega z pręd­ko­ścią znacz­nie więk­szą niż reak­cje nie­ka­ta­li­zo­wane. Anhy­draza węgla­nowa jako jeden z naj­szyb­ciej dzia­ła­jących enzy­mów jest w sta­nie prze­pro­wa­dzić w ciągu sekundy około 106 reak­cji two­rze­nia jonu wodo­ro­węgla­no­wego HCO3 z dwu­tlenku węgla CO2 i wody H2O, co ozna­cza około 107-krotne przy­spie­sze­nie pro­cesu w sto­sunku do reak­cji bez udziału kata­li­za­tora [1][2].

Cho­ciaż już wcze­śniej obser­wo­wano fakt tra­wie­nia sub­stan­cji białk­o­wych przez wydzie­liny żołądka poza orga­ni­zmem żywym [3], to dopiero w XIX i na początku XX wieku prace Luisa Pasteura, Wil­helma Kuhna oraz Edu­arda Buch­nera wyja­śniły istotę zja­wi­ska. Ten ostatni otrzy­mał w 1907 roku Nagrodę Nobla za prace nad enzy­mami pocho­dzącymi od drożdży [4].

Enzymy w zależn­o­ści od kata­li­zo­wa­nych przez nie reak­cji dzieli się na sześć pod­sta­wo­wych klas opa­trzo­nych tzw. nume­rami EC [5]:

Enzymy z punktu widze­nia bio­lo­gii pełnią rolę, której nie spo­sób prze­ce­nić. Dzięki temu, że biorą udział w prak­tycz­nie wszyst­kich pro­wa­dzo­nych w orga­ni­zmie żywym reak­cjach ana­bo­licz­nych i kata­bo­licz­nych okre­ślają cało­ś­ciowy ksz­tałt meta­bo­li­zmu. Enzymy różn­ego rodzaju, kata­li­zu­jąc okre­ślone reak­cje nie­jako kie­rują więc szla­kami meta­bo­licz­nymi w orga­ni­zmie.

Wyda­wać by się mogło, że możl­i­wość pracy z tak spe­cy­ficz­nymi sub­stan­cjami jak enzymy jest zare­zer­wo­wana jedy­nie dla spe­cja­li­stycz­nych labo­ra­to­riów. Nic bar­dziej myl­nego! Posta­ram się prze­ko­nać Czy­tel­nika, że obec­ność różn­o­rod­nych enzy­mów w mate­riale bio­lo­gicz­nym można wykryć nawet bar­dzo nie­skom­pli­ko­wa­nymi meto­dami. Myślę, że może to być bar­dzo pou­cza­jące, a jed­no­cze­śnie satys­fak­cjo­nu­jące dla każd­ego poszu­ki­wa­cza wie­dzy.

Ure­azy

Ure­azy są enzy­mami z klasy hydro­laz kata­li­zu­jącymi hydro­lizę mocz­nika CO(NH2)2 do amo­niaku NH3 i dwu­tlenku węgla CO2.

W cen­trum aktyw­nym enzy­mów z tej grupy w warun­kach natu­ral­nych występuje nikiel, ale w labo­ra­to­riach udało się osiągnąć aktyw­ność kata­li­tyczną przy pod­mia­nie tego metalu na man­gan oraz kobalt [6]. Masa cząstecz­kowa aktyw­nej formy enzymu wynosi około 500kDa.

Sub­stan­cja ta występuje w drożdżach, bak­te­riach (np. Heli­co­bac­ter pylori), ale też w niek­tórych rośli­nach wyższych, np. w kana­wa­lii mie­czo­ksz­tałt­nej Cana­va­lia ensi­for­mis nale­żącej do rodziny bobo­wa­tych Faba­ceae. Wła­śnie z tka­nek tej rośliny ure­aza została wyi­zo­lo­wana w 1926 roku przez Jamesa B. Sum­nera, który stwier­dził, że jest ona białk­iem [7].

Jako źródło ure­azy do naszych doświad­czeń dogod­nie będzie wyko­rzy­stać łatwo dostępne nasiona soi warzyw­nej Gly­cine max, dyni zwy­czaj­nej Cucur­bita pepo lub dyni olbrzy­miej Cucur­bita maxima. Nasiona mogą być suszone, ale ważne jest, żeby nie były pod­da­wane obróbce w pod­wyższo­nej tem­pe­ra­tu­rze.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.1 – Suro­wiec zawie­ra­jący ure­azę; A – nasiona soi warzyw­nej Gly­cine max w cało­ści, B – nasiona po utar­ciu w moździe­rzu

Nie­wielką ilość zawie­ra­jących ure­azę nasion - ja wyko­rzy­sta­łem soję - należy umie­ścić w moździe­rzu (Fot.1A). Są one dosyć twarde, lecz ucie­ra­jąc je otrzy­muje się po pew­nym cza­sie żółt­awą mączkę (Fot.1B). Pro­szek ten należy następ­nie roz­pro­wa­dzić w 20-30cm3 wody o tem­pe­ra­tu­rze poko­jo­wej i prze­sączyć. Nie sta­nowi żad­nego pro­blemu jeśli prze­sącz pozo­sta­nie nieco mętny (Fot.2). Płyn można prze­cho­wy­wać kilka dni w lodówce. Bez­po­śred­nio przed doświad­cze­niem dzie­limy objętość roz­tworu na dwie czę­ści. Pierw­szą należy pozo­sta­wić w spo­koju, drugą nato­miast zago­to­wać przez kilka minut do wrze­nia i sch­ło­dzić do tem­pe­ra­tury poko­jo­wej.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.2 – Wyciąg z nasion soi

By prze­ko­nać się o aktyw­no­ści kata­li­tycz­nej ure­azy należy przy­go­to­wać wodny roz­twór mocz­nika o stęże­niu około 8% z dodat­kiem kilku kro­pli alko­ho­lo­wego roz­tworu błękitu bro­mo­ty­mo­lo­wego C27H28Br2O5S. Ten ostatni pełni rolę wskaźn­ika odczynu i przy­biera w śro­do­wi­sku kwa­śnym (pH poni­żej 7) barwę żółtą, w zasa­do­wym nie­bie­ską (pH powy­żej 7), nato­miast w zbli­żo­nym do obo­jęt­nego (ph≈7) zie­loną.

Uzy­skany roz­twór powi­nien mieć pH zbli­żone do neu­tral­nego lub mini­mal­nie kwa­so­wego. Ewen­tu­alne zabar­wie­nie nie­bie­skie, świad­czące o zasa­do­wym cha­rak­te­rze śro­do­wi­ska należy usu­nąć przez nie­wielki doda­tek roz­cieńczo­nego kwasu, np. octo­wego CH3COOH.

Przy­go­to­wany roz­twór mocz­nika roz­le­wamy do trzech nie­wiel­kich zle­wek. Zawar­tość pierw­szej (Fot.3A) sta­nowi próbę kon­trolną, do dru­giej doda­jemy kilka cen­ty­me­trów sze­ścien­nych suro­wego wyciągu z nasion soi (Fot.3B), do trze­ciej nato­miast wyciągu zago­to­wa­nego wcze­śniej do wrze­nia (Fot.3C). Naczy­nia pozo­sta­wiamy na jakiś czas w spo­koju.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.3 – Aktyw­ność kata­li­tyczna wyciągu z nasion soi; A, D - roz­twór mocz­nika z dodat­kiem wskaźn­ika (roz­twór kon­trolny), B, E - roz­twór mocz­nika z dodat­kiem wyciągu sojo­wego i wskaźn­ika, C, F - roz­twór mocz­nika z dodat­kiem ogrza­nego do wrze­nia wyciągu sojo­wego i wskaźn­ika; górny rząd – roz­twory w momen­cie zmie­sza­nia (t=0min), dolny rząd – odpo­wied­nie roz­twory po cza­sie t=5min

Już po kilku minu­tach można zau­wa­żyć wyraźną zmianę barwy roz­tworu – staje się on nie­bie­ski. Dzieje się tak jed­nak tylko w przy­padku roz­tworu zawie­ra­jącego surowy wyciąg z nasion soi (Fot3.E). Jest to spo­wo­do­wane tym, że ure­aza, jak już wspom­niano, kata­li­zuje reak­cję opi­saną poniższym rów­na­niem:

CO(NH2)2 + H2O → CO2 + 2NH3

Pow­stały amo­niak w śro­do­wi­sku wod­nym hydro­li­zuje dalej według:

NH3 + H2O ⇌ NH4+ + OH

Śro­do­wi­sko reak­cji zostaje zal­ka­li­zo­wane, czego widocz­nym skut­kiem jest zmiana barwy roz­tworu zawie­ra­jącego wskaźnik pH.

Jeśli reak­cję pro­wa­dzić dłu­żej, to wyraźnie wyczu­walny staje się cha­rak­te­ry­styczny, drażn­iący zapach amo­niaku.

Rolę ure­azy pod­kre­śla brak oznak zacho­dze­nia jakiej­kol­wiek reak­cji w próbce kon­trol­nej. Naj­wy­raźn­iej ure­aza rze­czy­wi­ście przy­spie­szyła znacz­nie reak­cję mocz­nika z wodą w sto­sunku do reak­cji bez udziału kata­li­za­tora. W rze­czy­wi­sto­ści nawet po tygod­niach ocze­ki­wa­nia nie zau­wa­ży­li­by­śmy oznak zacho­dze­nia reak­cji w próbce kon­trol­nej.

Brak reak­cji w próbce trze­ciej pozwala sądzić, że pod­wyższona tem­pe­ra­tura jaką potrak­to­wano wyko­rzy­stany w tym przy­padku eks­trakt sojowy spo­wo­do­wała w jakiś spo­sób unie­czyn­nie­nie enzymu. Dodat­kowo, zanik funk­cji ure­azy jest trwały, ponie­waż sch­ło­dze­nie goto­wa­nego wyciągu do tem­pe­ra­tury poko­jo­wej nie przyw­róciło jej.

Zau­ważmy, że ure­aza może być w pew­nych warun­kach silną tru­ci­zną. Byłoby konieczne jed­nak poda­nie jej do krwio­o­biegu. W wyniku hydro­lizy mocz­nika, który w nie­wiel­kich ilo­ściach jest obecny w krwi, zosta­łaby ona zanie­czysz­czona tok­sycz­nym amo­nia­kiem [8]. Na szczę­ście jed­nak spo­ży­wa­nie pokar­mów zawie­ra­jących ure­azę nie nie­sie ryzyka – enzym zostaje po pro­stu stra­wiony podob­nie jak pozo­stałe białka.

Perok­sy­dazy

Kolej­nymi inte­re­su­jącymi enzy­mami są perok­sy­dazy nale­żące do klasy oksy­do­re­duk­taz. Enzymy te kata­li­zują reak­cje utle­nia­nia różn­o­rod­nych sub­stra­tów nad­tlen­kiem wodoru H2O2, według sche­matu (X – sub­strat, XO – pro­dukt utle­nia­nia):

H2O2 + X → H2O + XO

Perok­sy­dazy występują w tkan­kach zarówno zwie­rzęcych, jak i roślin­nych. Sto­sun­kowo dużo tych sub­stan­cji zawiera korzeń chrzanu pospo­li­tego Armo­ra­cia rusti­cana (Fot.4), pow­szech­nie występu­jącej i wyko­rzy­sty­wa­nej jako przy­prawa rośliny z rodziny kapu­sto­wa­tych Bras­si­ca­ceae.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.4 – Korzeń chrzanu pospo­li­tego Armo­ra­cia rusti­cana

Perok­sy­daza pocho­dząca z korze­nia chrzanu (ang. hor­se­ra­dish pero­xi­dase, HRP) jest gli­ko­pro­te­iną, tj. białk­iem, w którego skład wcho­dzą związane kowa­len­cyj­nie oli­go­sa­cha­rydy. Jej masa cząstecz­kowa wynosi 44kDa. Rolę koen­zymu pełni w tym przy­padku hem [9].

Aktyw­ność perok­sy­dazy występu­jącej w korze­niu chrzanu można wyka­zać na wiele spo­so­bów. Jed­nym z bar­dziej efek­tow­nych jest enzy­ma­tyczne utle­nia­nie lumi­nolu C8H7N3O2. By się o tym prze­ko­nać należy spo­rządzić alka­liczny roz­twór che­mi­lu­mi­no­foru poprzez roz­pusz­cze­nie w 100cm3 wody desty­lo­wa­nej 0,3g węglanu sodu Na2CO3 i 0,05g lumi­nolu. W razie braku węglanu sodu alka­liczne warunki można zapew­nić przez doda­tek nie­wiel­kiej ilo­ści wody amo­nia­kal­nej NH3(aq) lub ewen­tu­al­nie wodo­ro­tlenku sodu NaOH.

Bez­po­śred­nio przed doświad­cze­niem do roz­tworu dodaje się jesz­cze 5cm3 nad­tlenku wodoru o stęże­niu 3% (apteczna woda utle­niona). Do tak otrzy­ma­nej cie­czy należy wpro­wa­dzić następ­nie frag­ment korze­nia chrzanu, naj­le­piej wycięty z jego wnętrza (Fot.5). W razie braku chrzanu można zasto­so­wać korzeń pie­truszki zwy­czaj­nej Petro­se­li­num cri­spum, który także zawiera oma­wiany enzym.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.5 – Frag­ment korze­nia chrzanu zanu­rzony w roz­two­rze lumi­nolu

Po zaciem­nie­niu pomiesz­cze­nia można oglądać wtedy widok jak na Fot.6. Roz­twór w kon­tak­cie z tkanką roślinną zaczyna emi­to­wać wyraźnie zau­wa­żalne świa­tło, co jest cha­rak­te­ry­styczne dla reak­cji utle­nia­nia lumi­nolu w śro­do­wi­sku zasa­do­wym.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.6 – Che­mi­lu­mi­ne­scen­cja roz­tworu lumi­nolu w kon­tak­cie z tkanką korze­nia chrzanu

Doświad­cze­nie można prze­pro­wa­dzić też ina­czej, tj. nano­sząc pipetką pasteu­row­ską roz­twór na pla­ster będący prze­kro­jem poprzecz­nym korze­nia (Fot.7A). Można wtedy zau­wa­żyć, że lumi­ne­scen­cja nie jest jed­no­rodna – niek­tóre obszary powierzchni prze­kroju świecą wyraźnie sła­biej niż inne. Pomi­ja­jąc kwe­stie związane z mecha­nicz­nym usz­ko­dze­niem tkanki pod­czas pre­pa­ro­wa­nia mate­riału jest to spo­wo­do­wane różn­i­cami w zawar­to­ści perok­sy­daz.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.7 – Enzy­ma­tyczna che­mi­lu­mi­ne­scen­cja lumi­nolu; A – nanie­sie­nie roz­tworu lumi­nolu na powierzch­nię frag­mentu korze­nia, B – che­mi­lu­mi­ne­scen­cja roz­tworu w kon­tak­cie z tkanką roślinną

Wia­domo, że che­mi­lu­mi­ne­scen­cja lumi­nolu zacho­dzi pod wpły­wem różn­o­rod­nych akty­wa­to­rów, np. roz­pusz­czal­nych w zasa­do­wym śro­do­wi­sku związ­ków kom­plek­so­wych żelaza(III), kobaltu(II) i mie­dzi(II) [10]. W tym przy­padku jest jed­nak ina­czej, ponie­waż to wła­śnie zawarta w korze­niu chrzanu perok­sy­daza kata­li­zuje reak­cję utle­nia­nia lumi­nolu, co obja­wia się emi­sją nie­bie­skiego świa­tła.

Z racji faktu, że reak­cja che­mi­lu­mi­ne­scen­cji lumi­nolu jest kata­li­zo­wana m.in. przez hemo­glo­binę bywa on wyko­rzy­sty­wany w kry­mi­na­li­styce do wykry­wa­nia obec­no­ści krwi np. w miej­scu zbrodni. Plamy krwi pod wpły­wem lumi­nolu zaczy­nają wyraźnie świe­cić, co może być zaob­ser­wo­wane gołym okiem lub sfo­to­gra­fo­wane. Pro­ble­mem jest tutaj pow­szech­ność występo­wa­nia perok­sy­daz, które, jak się już prze­ko­na­li­śmy, także kata­li­zują tę reak­cję. To samo tyczy się innych metod, np. pole­ga­jących na kata­li­tycz­nym utle­nia­niu leu­ko­barw­ni­ków, np. bez­barw­nej leu­ko­fe­no­lo­fta­le­iny (feno­lo­fta­liny) do różo­wej w śro­do­wi­sku zasa­do­wym feno­lo­fta­le­iny lub nie wyka­zu­jącej flu­o­re­scen­cji leu­ko­flu­o­re­sce­iny (flu­o­re­scyny) do świe­cącej pod wpły­wem świa­tła UV flu­o­re­sce­iny [11]. Pew­nym roz­wiąza­niem opi­sy­wa­nego pro­blemu może być to, że perok­sy­dazy, podob­nie jak więk­szość enzy­mów, są wyraźnie wrażl­iwe na pod­wyższoną tem­pe­ra­turę. Krót­kie ogrza­nie bada­nej próbki do odpo­wied­niej tem­pe­ra­tury prak­tycz­nie eli­mi­nuje aktyw­ność tych sub­stan­cji, więc w razie zaist­nie­nia wyniku pozy­tyw­nego można być bar­dziej pew­nym obec­no­ści hemo­glo­biny, i co za tym idzie także krwi.

Dzia­ła­nie perok­sy­dazy można wyka­zać też poprzez kata­li­tyczne utle­nia­nie nad­tlen­kiem wodoru bez­barw­nej ben­zy­dyny C12H12N2 do barw­nych pro­duk­tów lub utle­nia­nie jodku potasu KI do wol­nego jodu, którego obec­ność można łatwo wykryć przy pomocy zawie­siny skrobi ziem­nia­cza­nej [12].

Pro­te­azy

Miano pro­teaz lub ina­czej enzy­mów pro­te­o­li­tycz­nych noszą takie sub­stan­cje che­miczne nale­żące do grupy hydro­laz, które kata­li­zują pro­te­o­lizę, czyli hydro­lizę wiązań pep­ty­do­wych. Wiąza­nie pep­ty­dowe to umowna nazwa wiąza­nia ami­do­wego występu­jącego między ami­no­kwa­sami two­rzącymi białka i pep­tydy.

Pro­te­azy bywają też nazy­wane pep­ty­da­zami. Można je podzie­lić na dwie główne grupy:

Pro­te­azy występują u zwie­rząt i roślin. W obu przy­pad­kach pełnią ważne role: w orga­ni­zmach zwie­rzęcych np. są jed­nymi z enzy­mów tra­wien­nych, w roślin­nych nato­miast często mają funk­cję och­ronną [13].

Pro­te­azy występują u wielu roślin. Wspom­nieć tu można o bro­me­li­nie (bro­me­la­i­nie) występu­jącej np. w owocu ana­nasa jadal­nego Ana­nas como­sus, akty­ni­dy­nie owo­ców akti­ni­dii sma­ko­wi­tej Acti­ni­dia deli­ciosa lub akti­ni­dii chińs­kiej Acti­ni­dia chi­nen­sis (kiwi), czy papa­i­nie występu­jącej w nie­doj­rza­łych owo­cach melo­nowca wła­ści­wego Carica papaya, nazy­wa­nego też papają.

Aby wyka­zać empi­rycz­nie wła­ści­wo­ści pro­teaz naj­ła­twiej wyko­rzy­stać owoce ana­nasa lub kiwi. Trzeba pamiętać jedy­nie, by uży­wać owo­ców świe­żych lub mro­żo­nych – pusz­ko­wane nie nadają się z racji zasto­so­wa­nej w tym przy­padku obróbki ciepl­nej.

Ja wyko­rzy­sta­łem owoc ana­nasa (Fot.8). Do doświad­cze­nia są potrzebne jedy­nie nie­wiel­kie ilo­ści mate­riału – resztę pole­cam wyko­rzy­stać w celu zasi­le­nia naszego orga­ni­zmu, czyli po pro­stu zjeść.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.8 – Owoc ana­nasa jadal­nego Ana­nas como­sus

Eks­trakt z owocu ana­nasa łatwo przy­go­to­wać roz­cie­ra­jąc nieco miąższu z nie­wielką ilo­ścią wody, a następ­nie prze­sącza­jąc uzy­skaną mie­sza­ninę. Uzy­skany płyn ma barwę żółtą (Fot.9). Można go prze­cho­wy­wać kilka dni w lodówce.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.9 – Eks­trakt z owocu ana­nasa

Jak jed­nak dowieść, że w owocu ana­nasa rze­czy­wi­ście są obecne roz­kła­da­jące białka bro­me­liny? Można w tym celu wyko­rzy­stać żela­tynę, czyli mie­sza­ninę pro­duk­tów czę­ścio­wej hydro­lizy kola­genu.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.10 – Efekt dzia­ła­nia pro­teaz z owocu ana­nasa na pro­ces zasty­ga­nia żela­tyny; A – roz­twór żela­tyny w wodzie (próba kon­trolna), B – roz­twór żela­tyny w wodzie z dodat­kiem wyciągu z ana­nasa (próba badana), C – żel pow­stały w przy­padku próby kon­trol­nej, D – brak wytwo­rze­nia żelu w próbie bada­nej

Należy przy­go­to­wać roz­twór żela­tyny poprzez roz­pusz­cze­nie 10g tej sub­stan­cji w 100cm3 gorącej wody. Po och­ło­dze­niu, ale jesz­cze przed roz­po­częciem pro­cesu żelo­wa­nia do jed­nej próbki trzeba dodać nieco wody (próba kon­trolna – Fot.10A), zaś do dru­giej taką samą ilość eks­traktu ana­na­so­wego (próba badana – Fot.10B). Obie próbki trzeba odsta­wić na kilka godzin w chłodne miej­sce.

Po pew­nym cza­sie można zau­wa­żyć, że w przy­padku próbki kon­trol­nej pow­stał sztywny żel (Fot.10C). Próbka zawie­ra­jąca wyciąg z ana­nasa w dal­szym ciągu pozo­staje jed­nak tak samo płynna jak na początku (Fot.10D). W próbce tej nie doj­dzie do wytwo­rze­nia żelu nawet po bar­dzo dłu­gim cza­sie. Jak to wyja­śnić?

Jak wiemy, w każdej tem­pe­ra­tu­rze wyższej od zera abso­lut­nego wszyst­kie cząstki poru­szają się (drgają) z pręd­ko­ściami tym więk­szymi, im jest ona wyższa. Tak więc w gorącym roz­two­rze żela­tyny dłu­gie łańc­u­chy białk­owe wyko­nują inten­sywne, przy­pad­kowe ruchy. Wraz ze spad­kiem tem­pe­ra­tury ruchy te słabną i zaczy­nają two­rzyć się wiąza­nia wodo­rowe między różn­ymi rejo­nami tego samego łańc­u­cha lub pomiędzy różn­ymi łańc­u­chami. Wiąza­nia wodo­rowe są bar­dzo słabe, lecz w tym przy­padku wraz ze spad­kiem tem­pe­ra­tury pow­staje ich tak wiele, że zaczy­nają one grać decy­du­jącą rolę przy agre­ga­cji dłu­gich łańc­u­chów poli­pep­ty­do­wych. W obrębie pow­sta­jącej struk­tury zostają uwięzione też cząsteczki wody, co pro­wa­dzi do pow­sta­nia żelu.

W razie obec­no­ści w roz­two­rze pro­teaz (np. pocho­dzącej z ana­nasa bro­me­liny) kata­li­zują one hydro­li­tyczny roz­kład wiązań pep­ty­do­wych. Pow­stają w ten spo­sób poje­dyn­cze ami­no­kwasy oraz frag­menty pep­ty­dowe, które są zbyt krót­kie by wyka­zy­wać zdol­ność do agre­ga­cji i two­rze­nia żelu.

Sub­stan­cją o wła­ści­wo­ściach podob­nych do żela­tyny jest agar (agar-agar) pozy­ski­wany z mor­skich kra­sno­ro­stów Rho­do­phyta. Układy zawie­ra­jące agar ule­gają jed­nak żelo­wa­niu nawet w przy­padku obec­no­ści dużych ilo­ści pro­teaz (Fot.11). Łatwo to wytłu­ma­czyć fak­tem, że w prze­ci­wieńs­twie do żela­tyny skła­da­jącej się z bia­łek i pep­ty­dów, głów­nym skład­ni­kiem agaru jest aga­roza, czyli wie­lo­cu­kier będący poli­me­rem pochod­nych galak­tozy C6H12O6. Pro­te­azy nie kata­li­zują roz­kładu cukrów, więc nie mają wpływu na pro­ces zesta­la­nia się roz­two­rów zawie­ra­jących agar.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.11 – Zel aga­ro­zowy pow­stały mimo obec­no­ści pro­teaz

Zau­ważmy, że z przed­sta­wio­nego doświad­cze­nia wynika, że nie da się spo­rządzić gala­retki o smaku ana­nasa, kiwi lub papai w opar­ciu o żela­tynę i natu­ralne soki z tych owo­ców. Odpo­wied­nio pod­wyższona tem­pe­ra­tura oczy­wi­ście dez­ak­ty­wuje enzymy, ale zmie­nia też smak gala­retki, co może być nie­ko­rzystne. Mimo wszystko, takie desery można oczy­wi­ście przy­rządzić przy wyko­rzy­sta­niu agaru.

Amy­lazy

Amy­lazy lub ina­czej enzymy amy­lo­li­tyczne są podob­nie jak pro­te­azy i ure­azy zali­czane do hydro­laz. Kata­li­zują one jed­nak roz­kład nie bia­łek lub mocz­nika, a skrobi i innych poli­sa­cha­ry­dów [14]. U zwie­rząt występują między innymi w śli­nie i soku trzust­ko­wym, zaś u roślin np. w owo­cach lub kiełk­u­jących nasio­nach.

Z racji dostęp­no­ści surowca posta­ramy się potwier­dzić amy­lo­li­tyczne wła­ści­wo­ści amy­lazy śli­no­wej (daw­niej nazy­wa­nej ptia­liną).

By spo­rządzić roz­twór wyj­ściowy, należy roz­pro­wa­dzić kilka gra­mów skrobi ziem­nia­cza­nej w 100cm3 gorącej wody, po czym prze­sączyć i och­ło­dzić.

Roz­two­rem skrobi napełn­iamy trzy pro­bówki. Pierw­sza, tj. bez żad­nych dodat­ków, będzie sta­no­wić próbę kon­trolną (Fot.12A). Do dru­giej należy dodać nie­wielką ilość śliny roz­cieńczo­nej pięcio­krot­nie wodą desty­lo­waną (Fot.12B), zaś do trze­ciej podobną ilość roz­tworu śliny dopro­wa­dzo­nego na krótko do wrze­nia (Fot.12C). Ciecz we wszyst­kich pro­bów­kach jest bez­barwna. Roz­twory pozo­sta­wiamy na prze­ciąg godziny lub dwóch w tem­pe­ra­tu­rze poko­jo­wej. Jeśli nato­miast pod­grze­jemy je do tem­pe­ra­tury około 37°C to wystar­czy już kil­ka­na­ście minut.

Po upły­wie tego czasu należy zba­dać zawar­tość naczyń. Wszyst­kie trzy roz­twory zdają się nie wyka­zy­wać oznak żad­nych zmian – ciecz jest w dal­szym ciągu bez­barwna (Fot.12D, E, F). Chcąc się jed­nak prze­ko­nać o zawar­to­ści skrobi wystar­czy dodać do nich kilka kro­pli aptecz­nej jodyny, czyli alko­ho­lo­wego lub wod­nego (z dodat­kiem jodku potasu KI) roz­tworu jodu.

Wynik może być pew­nym zasko­cze­niem, ponie­waż cha­rak­te­ry­styczne gra­na­towe zabar­wie­nie kom­pleksu jodu ze skro­bią można zaob­ser­wo­wać jedy­nie w przy­padku roz­tworu nie zawie­ra­jącego amy­lazy (Fot.12G) oraz tego, w skład którego wcho­dził roz­twór amy­lazy pod­grzany wcze­śniej do tem­pe­ra­tury wrze­nia (Fot.12I), co spo­wo­do­wało dez­ak­ty­wa­cję enzymu. W przy­padku roz­tworu zawie­ra­jącego amy­lazę nie zaob­ser­wo­wano gra­na­to­wego zabar­wie­nia kom­pleksu, a jedy­nie brązowe pocho­dzące od roz­pusz­czo­nego jodu. Naj­wy­raźn­iej enzym rze­czy­wi­ście spo­wo­do­wał roz­kład dłu­go­łańc­u­cho­wych poli­sa­cha­ry­dów wcho­dzących w skład skrobi, do krót­szych, które nie dają zabar­wie­nia z jodem.

Ilustracja:

Kliknij, aby powiększyć

Fot.12 - Dzia­ła­nie amy­lazy na skro­bię w tem­pe­ra­tu­rze 37ºC; A, D, G - roz­twór skrobi (próba kon­trolna), B, E, H - roz­twór skrobi z dodat­kiem śliny (próba badana), C, F, I - roz­twór skrobi z dodat­kiem pod­grza­nej śliny; górny rząd - roz­twory po przy­go­to­wa­niu, środ­kowy rząd - roz­twory po upły­wie 15 minut od przy­go­to­wa­nia (brak widocz­nych zmian), dolny rząd - roz­twory po upły­wie 15 minut z dodat­kiem jodyny (G, I - gra­na­towe zabar­wie­nie kom­pleksu skrobi z jodem, H - brak gra­na­to­wego zabar­wie­nia)

Amy­laza śli­nowa roz­kłada skro­bię na mal­tozę i dek­stryny, co można trak­to­wać jako wstępny etap tra­wie­nia poli­sa­cha­ry­dów, który roz­po­czyna się już w jamie ust­nej.

Wyja­śnie­nie

Jak widać, enzymy nie tylko występują prak­tycz­nie wszędzie wokół nas (i w nas samych), ale też nie jest wcale trudno je wykryć i prze­ko­nać się samo­dziel­nie o ich wła­ści­wo­ściach.

Enzymy to w więk­szo­ści łańc­u­chy białk­owe o zróżn­i­co­wa­nej dłu­go­ści, od kil­ku­dzie­sięciu (np. tau­to­me­raza 4-okso­kro­to­nianu) do ponad 2500 ami­no­kwa­sów w łańc­u­chu (zwie­rzęca syn­taza kwa­sów tłusz­czo­wych) [15][16]. Rejon łańc­u­cha, który wiąże się i oddzia­łuje z sub­stra­tem oraz zawiera klu­czowe dla prze­biegu reak­cji ami­no­kwasy nazy­wany jest cen­trum aktyw­nym enzymu. Prócz sub­stratu enzymy mogą wiązać także inne cząsteczki, np. kofak­tory mogące regu­lo­wać aktyw­ność kata­li­tyczną.

W komór­kach żywych enzymy są syn­te­zo­wane przy udziale rybo­so­mów jako dłu­gie łańc­u­chy ami­no­kwa­sowe, które nabie­rają potem odpo­wied­niej struk­tury prze­strzen­nej. Wła­ści­wo­ści enzymu są okre­ślane wła­śnie przez kon­for­ma­cję prze­strzenną. Wysoka tem­pe­ra­tura powo­duje dena­tu­ra­cję bia­łek, czyli pewne zmiany w struk­tu­rze, co pociąga za sobą oczy­wi­ście utratę aktyw­no­ści kata­li­tycz­nej. Zaob­ser­wo­wa­li­śmy to w odnie­sie­niu do opi­sy­wa­nych enzy­mów.

Wpływ tem­pe­ra­tury w prze­dziale nie­de­na­tu­ru­jącym na dzia­ła­nie enzy­mów jest także łatwy do zaob­ser­wo­wa­nia, szcze­gól­nie w przy­padku amy­lazy – im wyższa tem­pe­ra­tura, tym szyb­szy postęp reak­cji. Więk­szość enzy­mów działa z naj­więk­szą wydaj­no­ścią w okre­ślo­nym prze­dziale tem­pe­ra­tury i pH śro­do­wi­ska.

Cha­rak­te­ry­styczna dla enzy­mów jest także bar­dzo wysoka spe­cy­ficz­ność sub­stra­towa, z reguły znacz­nie wyższa niż spe­cy­ficz­ność kata­li­za­to­rów nie­or­ga­nicz­nych. Zau­ważmy, że pro­te­azy pocho­dzące z ana­nasa roz­ło­żyły jedy­nie białka wcho­dzące w skład żela­tyny, nie dając żad­nego zau­wa­żal­nego skutku w przy­padku agaru. Może to nieco dzi­wić, bo prze­cież zarówno białka, jak i poli­sa­cha­rydy są zbu­do­wane z dłu­gich poli­me­rycz­nych łańc­u­chów. Enzymy wyka­zują często nawet dużo dalej idącą spe­cy­ficz­ność co do sub­stra­tów kata­li­zo­wa­nych reak­cji. Mecha­nizm reak­cji enzy­ma­tycz­nych bywa opi­sy­wany za pomocą wielu teo­re­tycz­nych modeli, np. „klu­cza i zamka” (ang. „lock and key”), trzy­punk­to­wego dołącze­nia (ang. three-point inte­rac­tion model) i indu­ko­wa­nego dopa­so­wa­nia (ang. indu­ced fit model).

Bada­niem wszyst­kich aspek­tów mających związek z występo­wa­niem, budową i rolą enzy­mów, a także mecha­ni­zmami ich dzia­ła­nia oraz wyko­rzy­sta­niem zaj­muje się prężnie roz­wi­ja­jąca dzie­dzina wie­dzy jaką jest enzy­mo­lo­gia.

Na dzia­ła­nie enzy­mów wpływ mają też inne czyn­niki, np. obec­ność jonów metali. Można w tej dzie­dzi­nie prze­pro­wa­dzić wiele inte­re­su­jących doświad­czeń, do czego gorąco zachęcam Czy­tel­nika.

Lite­ra­tura:

W powyższym tek­ście doko­nano nie­wiel­kich zmian edy­tor­skich w sto­sunku do wer­sji opu­bli­ko­wa­nej w  cza­so­pi­śmie, w celu uzu­pełn­ie­nia i lep­szego przy­sto­so­wa­nia do pre­zen­ta­cji na stro­nie inter­ne­to­wej.

Marek Ples

Aa