Weird Science

Czy to jest krew?

Poniższy arty­kuł został opu­bli­ko­wany pier­wot­nie w cza­so­pi­śmie dla nau­czy­cieli Bio­lo­gia w Szkole (2/2022):

Ilustracja

Ples M., Czy to jest krew? Mała kry­mi­na­li­styka, Bio­lo­gia w Szkole, 4 (2022), Forum Media Pol­ska Sp. z o.o., str. 53-56

Zatrzy­majmy się na chwilę przy naszej pod­ręcz­nej biblio­tece. Bez względu na to, czy kry­mi­nały są one naszym ulu­bio­nym gatun­kiem lite­rac­kim czy też nie, książki Aga­thy Chri­stie są - moim skrom­nym zda­niem - poza wszelką kry­tyką [1]. Nie­o­dża­ło­wany Her­ku­les Poi­rot w jed­nej z nich stwier­dza, że:

Zabój­stwo pozo­staje zabój­stwem bez względu na to, czy je popełn­iono wczo­raj, czy przed sze­s­na­stu laty.

Chri­stie A., Pięć małych świ­nek

tłum: Kul­czycka-Dąmb­ska I.

Nie można odmówić temu racji. Skąd jed­nak możemy wie­dzieć, czy rze­czy­wi­ście doszło do mor­der­stwa, czy może zaist­niał tylko niesz­częśliwy wypa­dek? Wtedy roz­po­czyna się śledz­two…

Jedną z naj­ważn­iej­szych spraw jest stwier­dze­nie obec­no­ści krwi na miej­scu zbrodni, na przed­mio­tach mogących być jej narzędziami, albo nale­żących do podej­rza­nego. Współcze­sny śled­czy ma jed­nak w zana­drzu więcej pomoc­nych metod niż mógłby śnić boha­ter z kart powie­ści Pani Chri­stie. Jedną z nich jest tech­nika wykry­wa­nia obec­no­ści nawet bar­dzo małych ilo­ści krwi oparta na wła­ści­wo­ściach che­mi­lu­mi­ne­scen­cyj­nych spe­cy­ficz­nych sub­stan­cji.

Doświad­cze­nie

Che­mi­lu­mi­ne­scen­cję możemy okre­ślić jako zja­wi­sko, pod­czas którego docho­dzi do emi­sji pro­mie­nio­wa­nia elek­tro­ma­gne­tycz­nego - głów­nie z zakresu świa­tła widzial­nego, ale wiele defi­ni­cji dopusz­cza tu także pro­mie­nio­wa­nie nad­fio­le­towe i pod­czer­wone - w wyniku spe­cy­ficz­nych reak­cji che­micz­nych. Pow­sta­jące wtedy pro­dukty ist­nieją w ter­mo­dy­na­micz­nie nie­tr­wa­łym sta­nie wzbu­dzo­nym, by przejść następ­nie do stanu pod­sta­wo­wego o niższej ener­gii, a jej różn­ica jest odda­wana do śro­do­wi­ska (bez­po­śred­nio lub za pośred­nic­twem innych mole­kuł) w for­mie świa­tła [2].

Wiele sub­stan­cji wyka­zuje zdol­ność do che­mi­lu­mi­ne­scen­cji, między innymi lucy­fe­ryna z lucy­fe­razą (co wyko­rzy­stują na przy­kład chrząsz­cze z rodziny świe­tli­ko­wa­tych Lam­py­ri­dae), biały fos­for, sin­gle­towa odmiana tlenu, lofina, układ piro­ga­lol-for­mal­de­hyd, poli­fe­nole z zie­lo­nej her­baty, silok­sen Wöh­lera będacy cie­ka­wym związ­kiem krze­mo­or­ga­nicz­nym i wiele innych.

Wydaj­nym che­mi­lu­mi­no­fo­rem jest lumi­nol C8H7N3O2, czyli hydra­zyd kwasu 3-ami­no­fta­lo­wego (Rys.1). Lumi­nol w warun­kach nor­mal­nych ma zwy­kle postać drob­no­kry­sta­licz­nego proszku, o bar­wie od kre­mo­wej, przez żółt­awą aż do jasno­brązo­wej [3].

Ilustracja
Rys.1 – Wzór struk­tu­ralny lumi­nolu

Co cie­kawe, w odpo­wied­nich warun­kach lumi­nol może umożl­i­wiać wykry­cie nawet bar­dzo nie­wiel­kich ilo­ści krwi, czy raczej zawar­tego w ery­tro­cy­tach czer­wo­nego barw­nika odde­cho­wego, jakim jest hemo­glo­bina.

Aby przy­go­to­wać odczyn­nik pozwa­la­jący na wykry­wa­nie krwi potrze­bu­jemy jesz­cze jedy­nie wodo­ro­tle­nek potasu KOH (lub sodu NaOH) i nad­tlenku wodoru H2O2 o stęże­niu 3%, czyli naj­zwy­klej­szej wody utle­nio­nej dostęp­nej w apte­kach.

Przy­stępu­jąc do doświad­cze­nia musimy w objęto­ści około 20cm3 wody desty­lo­wa­nej roz­pu­ścić kilka gra­nu­lek wodo­ro­tlenku potasu – ilość nie jest kry­tyczna. Następ­nie do zal­ka­li­zo­wa­nego roz­tworu doda­jemy odro­binę lumi­nolu – porów­na­nie z łeb­kiem od zapałki niech będzie wska­zówką jak nie­wielka ilość tej sub­stan­cji jest potrzebna (Fot.1).

Fot.1 – Ilość lumi­nolu potrzebna do przy­go­to­wa­nia roz­tworu

Warto zazna­czyć, że lumi­nol bar­dzo słabo roz­pusz­cza się w czy­stej wodzie, a znacz­nie lepiej w roz­two­rze zasady. Do roz­tworu doda­jemy następ­nie 5cm3 nad­tlenku wodoru w postaci wody utle­nio­nej. Gotowy odczyn­nik jest pra­wie bez­barwny, ma jedy­nie bar­dzo deli­katny żółty odcień (Fot.2).

Fot.2 – Odczyn­nik do wykry­wa­nia krwi

Tak przy­go­to­wany odczyn­nik jest nie­stety nie­tr­wały i musi zostać dosyć szybko zużyty – naj­le­piej w ciągu mak­sy­mal­nie kilku godzin. Alka­liczny roz­twór lumi­nolu możemy prze­cho­wy­wać dłu­żej w ciem­no­ści i w lodówce, ale w takim przy­padku nad­tle­nek wodoru musimy do niego dodać bez­po­śred­nio przed wyko­rzy­sta­niem.

Chcąc wypróbo­wać odczyn­nik natra­fiamy na pro­blem, ponie­waż jest w tym celu potrzebna krew. Chciałbym w tym miej­scu prze­strzec przed wyko­rzy­sta­niem nawet nie­wiel­kich próbek krwi o nie­zna­nym pocho­dze­niu, ponie­waż mogą one sta­no­wić czyn­nik zakaźny. Dobrym i bez­piecz­nym spo­so­bem jest wyko­rzy­sta­nie suszo­nej krwi zwie­rzęcej - np. wie­przo­wej – dostęp­nej w han­dlu i wyko­rzy­sty­wa­nej np. przez węd­ka­rzy do zanęca­nia ryb. Foto­gra­fia 3 przed­sta­wia wyi­zo­lo­waną i suszoną hemo­glo­binę bydlęcą wyko­rzy­staną w moich doświad­cze­niach.

Fot.3 – Suszona hemo­glo­bina

Prze­lejmy nieco naszego odczyn­nika do nie­wiel­kiej zlewki i dodajmy do niego kro­plę krwi lub szczyptę suchego pre­pa­ratu (krwi suszo­nej lub izo­latu hemo­glo­biny). Jak widać na Fot.4A izo­lat unosi się na powierzchni płynu – możemy jedy­nie zau­wa­żyć deli­katne pie­nie­nie się roz­tworu z powodu wywiązy­wa­nia się tlenu w wyniku roz­kładu nad­tlenku wodoru.

Fot.4 – Reak­cja ujaw­nia­jąca obec­ność krwi; A – na świe­tle, B – w ciem­no­ści

W ciem­no­ści jed­nak z łatwo­ścią zau­wa­żymy, że roz­twór w kon­tak­cie z sub­stan­cją zawie­ra­jącą hemo­glo­binę zaczyna wyraźnie świe­cić na piękny, nie­bie­ski kolor (Fot.4B). Jeśli płyn zamie­szać, to efekt staje się jesz­cze bar­dziej wido­wi­skowy, ponie­waż cała objętość roz­tworu roz­bły­skuje jasnym świa­tłem (Fot.5).

Fot.5 – Efekt po zamie­sza­niu roz­tworu

Opi­saną reak­cję rze­czy­wi­ście wyko­rzy­stuje się jako wstępny test obec­no­ści krwi na miej­scu dom­nie­ma­nej zbrodni lub w odnie­sie­niu do kon­kret­nych narzędzi. Robi się to przez spry­ska­nie roz­two­rem obszaru lub przed­miotu będącego obiek­tem zain­te­re­so­wa­nia. Obser­wa­cji nie doko­nuje się gołym okiem z racji faktu, że emi­to­wane sygnały świetlne mogą być zbyt słabe – pomocą są tu foto­gra­fie o wydłu­żo­nym cza­sie naświe­tla­nia.

Opi­sana metoda ma jed­nak wiele ogra­ni­czeń. Aby poznać jedno z nich, a także spo­sób jak je prze­zwy­ciężyć, musimy przy­go­to­wać pro­stą symu­la­cję sytu­a­cji z miej­sca zbrodni. W tym celu na kartce czy­stego papieru w okre­ślo­nym miej­scu roze­trzyjmy nieco świe­żej lub suszo­nej krwi, albo izo­latu hemo­glo­biny, a tuż obok np. nieco płynu wyci­śniętego z korze­nia pie­truszki zwy­czaj­nej Petro­se­li­num cri­spum lub chrzanu pospo­li­tego Armo­ra­cia rusti­cana. Papier należy potem wysu­szyć w tem­pe­ra­tu­rze poko­jo­wej, naj­le­piej dala od bez­po­śred­niego oświe­tle­nia świa­tłem sło­necz­nym. Oba miej­sca na kartce oznaczmy za pomocą okręgu nary­so­wa­nego ołów­kiem, jak to widać na Fot.6.

Fot.6 – Test spe­cy­ficz­no­ści odczyn­nika; a – plama roz­tar­tej hemo­glo­biny, b – plama wyciągu z korze­nia pie­truszki; u góry – na świe­tle, przed spry­ska­niem roz­two­rem, u dołu – w ciem­no­ści po spry­ska­niu roz­two­rem (ISO­400, czas eks­po­zy­cji: 5s)

Jak widać, po spry­ska­niu roz­two­rem odczyn­nika w ciem­no­ści możemy zau­wa­żyć, że rze­czy­wi­ście plama roz­twar­tej krwi (hemo­glo­biny) zaczyna świe­cić. Co cie­kawe, oka­zuje się, że także sub­stan­cje che­miczne zawarte w wyciągu z korze­nia pie­truszki mają taką samą wła­ści­wość kata­li­zo­wa­nia reak­cji che­mi­lu­mi­ne­scen­cji lumi­nolu. Nie­stety, che­mi­lu­mi­ne­scen­cji powo­do­wa­nej przez skład­niki krwi nie można odróżnić w ten pro­sty spo­sób od świe­ce­nia na sku­tek kon­taktu z wie­loma wyciągami roślin­nymi, które z różn­ych względów mogą być obecne pra­wie wszędzie.

Sprawdźmy jed­nak, jaki wpływ na doświad­cze­nie wyw­rze pod­wyższona tem­pe­ra­tura. Drugi przy­go­to­wany w taki sam spo­sób arkusz papieru z nanie­sio­nymi pla­mami inte­re­su­jących nas sub­stan­cji wysuszmy w pod­wyższo­nej (do co najm­niej 60°C) tem­pe­ra­tu­rze, np. poprzez pra­so­wa­nie żelaz­kiem, a następ­nie spry­skajmy odczyn­ni­kiem jak poprzed­nio (Fot.7).

Fot.7 – Test spe­cy­ficz­no­ści odczyn­nika (po trak­to­wa­niu próbek pod­wyższoną tem­pe­ra­turą); a – plama roz­tar­tej hemo­glo­biny, b – plama wyciągu z korze­nia pie­truszki; u góry – na świe­tle, przed spry­ska­niem roz­two­rem, u dołu – w ciem­no­ści po spry­ska­niu roz­two­rem (ISO­400, czas eks­po­zy­cji: 5s)

Zau­ważmy, że w wyniku trak­to­wa­nia pod­wyższoną tem­pe­ra­turą plama wyciągu roślin­nego stra­ciła zdol­ność do wywo­ły­wa­nia świe­ce­nia odczyn­nika, nato­miast plama z roz­tar­tej krwi ją zacho­wała. Jak więc widzimy, pod­grza­nie próbek pozwala na eli­mi­na­cję fałszy­wie pozy­tyw­nych wyni­ków pocho­dzących od wyciągów roślin­nych.

Dodat­kowo, musimy pamiętać, że test z wyko­rzy­sta­niem odczyn­nika lumi­no­lo­wego jest nisz­czący, to zna­czy próbek, na których go prze­pro­wa­dzono nie możemy zasto­so­wać w dal­szych ana­li­zach. Ze względu na ogra­ni­cze­nia należy opi­sany test trak­to­wać jako metodę wstępną lub wspo­ma­ga­jącą.

Wyja­śnie­nie

Mecha­nizm reak­cji polega na utle­nia­niu lumi­nolu w śro­do­wi­sku zasa­do­wym w obec­no­ści kata­li­za­tora. W zasa­do­wym roz­two­rze lumi­nol dyso­cjuje do postaci dwu­u­jem­nego anionu. W wyniku tau­to­me­ry­za­cji keto-eno­lo­wej pow­stają dwie różn­iące się budową i roz­miesz­cze­niem ładunku ujem­nego formy: keto­nowa, gdzie ładu­nek ujemny jest zlo­ka­li­zo­wany na ato­mach azotu, oraz eno­lowa, z ładun­kiem zgro­ma­dzo­nym na ato­mach tlenu. Dal­szej reak­cji ulega forma eno­lowa. Zostaje ona utle­niona w śro­do­wi­sku alka­licz­nym przez nad­tle­nek wodoru, czego pro­duk­tem jest cykliczny nad­tle­nek. Z racji ist­nie­nia w jego struk­tu­rze mostku nad­tlen­ko­wego to indy­wi­duum che­miczne jest wysoce nie­tr­wałe, przez co docho­dzi szybko do jego spon­ta­nicz­nego roz­padu, czego pro­duk­tem jest cząsteczka azotu oraz 3-ami­no­fta­lan. Co ważne, ten ostatni związek pow­staje w sta­nie wzbu­dzo­nym, który prze­cho­dzi do stanu pod­sta­wo­wego. Zgod­nie z zasadą zacho­wa­nia nad­wyżka ener­gii zostaje wypro­mie­nio­wana do śro­do­wi­ska pod posta­cią świa­tła, tutaj nie­bie­skiego.

Kata­li­za­to­rem reak­cji mogą być różn­ego rodzaju związki kom­plek­sowe np. żelaza. W wielu doświad­cze­niach z lumi­no­lem jako kata­li­za­tor reak­cji sto­suje się hek­sa­cy­ja­no­że­la­zian(III) potasu K3[Fe(CN)6], lecz jest on oczy­wi­ście nie­o­becny we krwi.

W przy­padku krwi kata­li­za­to­rem opi­sy­wa­nej reak­cji jest hemo­glo­bina. Składa się ona z czę­ści białk­o­wej – glo­biny - oraz pro­ste­tycz­nego hemu o struk­tu­rze zbli­żo­nej do por­fi­ryn (rys. 2) [4]. W cząsteczce hemu odpo­wied­nia por­fi­ryna posiada kation żelaza unie­ru­cho­miony przez cztery wiąza­nia żelazo-azot. For­mal­nie dwa z nich to wiąza­nia kowa­len­cyjne, a dwa koor­dy­na­cyjne, choć w rze­czy­wi­sto­ści są one rów­no­cenne.

Ilustracja
Rys.2 – Wzór struk­tu­ralny hemu

Trzeba zazna­czyć, że podobną reak­cję dają liczne roślinne enzymy, na przy­kład perok­sy­dazy występu­jące w korze­niu chrzanu lub pie­truszki. Są to oczy­wi­ście białka, więc dzia­ła­nie wysoką tem­pe­ra­turą powo­duje ich dena­tu­ra­cję i utratę zdol­no­ści kata­li­tycz­nej. Hem, jako kom­po­nent nie­białk­owy jest bar­dziej odporny na pod­wyższoną tem­pe­ra­turę i dzięki temu możemy wyko­nać test różn­i­cu­jący.



Lite­ra­tura:

Auto­rem foto­gra­fii i rysun­ków jest Marek Ples.

W powyższym tek­ście doko­nano nie­wiel­kich zmian edy­tor­skich w sto­sunku do wer­sji opu­bli­ko­wa­nej w  cza­so­pi­śmie, w celu uzu­pełn­ie­nia i lep­szego przy­sto­so­wa­nia do pre­zen­ta­cji na stro­nie inter­ne­to­wej.

Marek Ples

Aa